2結(jié)果與討論

2.1乙酰化SLs和去乙酰化SLs組分

2類SLs同系物HPLC-MS/MS鑒定結(jié)果表明，乙酰化SLs含有14種同系物（圖1A），去乙酰化SLs具有16種同系物（圖1B）。

圖1乙酰化SLs（A）和去乙酰化SLs（B）的HPLC-MS/MS總離子流圖

相比較而言，去乙酰化SLs同系物的保留時間較短，說明這些同系物的極性增大。其中，乙酰化SLs同系物的總離子流圖（圖1A）中保留時間為23.6 min處的峰的豐度最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為42.47%，其質(zhì)譜碎片如圖2A所示。質(zhì)荷比（m/z）為689.3754的峰為具有C18∶1單不飽和脂肪酸部分的二乙酰化內(nèi)酯型SLs的分子離子峰，m/z 711.3576為［M+Na］+峰，m/z 671.3644和653.3537分別為［M+H］+失去1個水分子和2個水分子的峰，m/z 485.3113和467.3006分別為［M+H］+失去1個己糖環(huán)和再失去1個水分子的峰。上述分析表明，保留時間為23.6 min的組分為帶有單不飽和度的C18脂肪酸鏈的雙乙酰化內(nèi)酯型SLs，即，17-L-［（2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基）-O-］-十八碳烯酸-1，4-內(nèi)酯-6′，6″-二乙酸酯。

圖2（A）乙酰化SLs保留時間為23.6 min組分的質(zhì)譜圖.（B）去乙酰化SLs保留時間為20.3 min組分的質(zhì)譜圖.（C）去乙酰化SLs保留時間為9.4 min組分的質(zhì)譜圖.（D）去乙酰化SLs保留時間為7.6 min組分的質(zhì)譜圖

在去乙酰化SLs同系物的總離子流圖中，保留時間為20.3 min的峰具有最高的豐度，達(dá)到16.96%，所對應(yīng)的質(zhì)譜碎片如圖2B所示，其中，m/z 597.5090為［M+H］+峰，m/z 619.4906為［M+Na］+峰，該組分與保留時間為9.4 min的組分具有相同的［M+Na］+和［M+H］+峰（圖2C），推測這2種組分可能為同分異構(gòu)體；對于保留時間為9.4 min的質(zhì)譜圖（圖2C），其中，m/z 619.3302和597.3479分別為［M+Na］+峰和［M+H］+峰，而m/z 435.2949和273.2423分別是［M+H］+失去1個和2個去乙酰化的己糖環(huán)（C6H10O5）形成的，m/z 273.2423（C16H33O3）是質(zhì)子化的C16∶0羥基脂肪酸。上述分析表明，保留時間20.3和9.4 min的組分分別為ω型和ω-1型C16∶0的去乙酰化酸型SLs，即16-L-［（2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基）-O-］-十六酸和15-L-［（2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基）-O-］-十六酸。

去乙酰化SLs保留時間為7.6 min質(zhì)譜（圖2D）中的離子m/z 1011.4614和m/z 989.4785分別為某組分的［M+Na］+峰和［M+H］+峰，［M+H］+峰連續(xù)失去2個己糖環(huán)基團(tuán)得到離子m/z 827.4266和m/z 623.3640，然后繼續(xù)失去1個單乙酰化己糖環(huán)基團(tuán)得到離子m/z 461.3102，最后再失去1個己糖環(huán)基團(tuán)得到離子m/z 299.2577。離子m/z 299.2577（C18H35O3）是質(zhì)子化的羥基脂肪酸Y0，說明該SLs分子為bola型且含有C18∶1羥基脂肪酸。綜上推測該組分為C18∶1的單乙酰化bola型SLs。

表1、表2和圖3分別顯示了乙酰化SLs和去乙酰化SLs的同系物組分及3種有代表性的同系物結(jié)構(gòu)圖，從表中可以看出，乙酰化SLs的親水基主要為雙乙酰化的槐糖，雙乙酰化組分高達(dá)92.50%；疏水基以十八碳的疏水基為主，其中十八烯酸疏水基質(zhì)量分?jǐn)?shù)為47.95%；內(nèi)酯類型的SLs質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.86%。去乙酰化SLs同系物中的疏水基中十八烯酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)到27.87%，親水基主要為去乙酰化的槐糖，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90.56%，即使發(fā)酵菌株被敲除了乙酰化關(guān)鍵基因，該產(chǎn)物中仍然有9.44%的單乙酰化槐糖脂，可能胞內(nèi)存在其他低效率的乙酰化途徑，具體原因有待進(jìn)一步研究。去乙酰化SLs同系物中含有內(nèi)酯型、酸型和bola型SLs，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為26.99%、49.98%和23.03%；而乙酰化SLs同系物中以內(nèi)酯型為主，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到97.86%，酸型同系物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.14%，未發(fā)現(xiàn)bola型SLs。這是由于乙酰化SLs菌株和去乙酰化SLs菌株對底物的代謝途徑和效率不同。乙酰轉(zhuǎn)移酶基因AT的敲除使大部分SLs分子不再發(fā)生乙酰化。在去乙酰化SLs產(chǎn)品中bola型SLs分子質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)23.03%，與Saerens等的研究結(jié)果一致。

這是由于乙酰轉(zhuǎn)移酶基因AT的缺失觸發(fā)了bola型SLs的大量合成，去乙酰化SLs同系物上葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ和Ⅱ作用于酸型SLs的羧基端進(jìn)行糖基化，使其額外連接2個葡萄糖，生成bola型SLs，而乙酰化結(jié)構(gòu)的SLs則不能發(fā)生這種途徑的糖基化反應(yīng)。以上結(jié)果表明，去乙酰化SLs菌株所產(chǎn)SLs以非乙酰化的酸型SLs為主，并能夠合成bola型SLs，具有比乙酰化SLs產(chǎn)品更豐富多樣的同系物結(jié)構(gòu)。

表1乙酰化SLs同系物組分和質(zhì)量分?jǐn)?shù)(Continued from previous page)

表2去乙酰化SLs同系物組分和質(zhì)量分?jǐn)?shù)(Continued from previous page)

圖3 3種有代表性的槐糖脂結(jié)構(gòu)式：（A）雙乙酰化內(nèi)脂型槐糖脂；（B）去乙酰化酸型槐糖脂；（C）去乙酰化bola型槐糖脂