1.2.6總游離巰基和表面游離巰基測(cè)定

蛋清液和不同干燥方式蛋清粉之間蛋白質(zhì)中總游離巰基和表面游離巰基的區(qū)別，摩爾消光系數(shù)為13600 M?1cm?1。

1.2.7傅里葉變換紅外光譜（Fourier Transform Infrared Spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析

用瑪瑙研缽將蛋清粉樣品磨細(xì)，將樣品與溴化鉀混合，壓成片狀后測(cè)量。25℃下，在4000~500 cm?1的波數(shù)范圍內(nèi)對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行分析。每個(gè)樣品以空氣為背景、KBr為空白對(duì)照進(jìn)行掃描。每次測(cè)量都是32次掃描的疊加。用Omnic軟件基線校正和傅里葉自取卷積后使用PeakFit軟件對(duì)1600~1700 cm?1區(qū)域進(jìn)行歸一化。利用高斯峰和曲線擬合模型對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)組分進(jìn)行定量估計(jì)。

1.2.8溶解度測(cè)定

稱取0.2 g蛋清粉溶解于20 mL DDW，用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH將溶液的pH調(diào)節(jié)至2.0，4.0，6.0，8.0和10.0，混合溶液在30℃下以100 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌30 min，然后7500×g，離心10 min，取上清，用Lowry法測(cè)定上清液蛋白質(zhì)含量。全蛋白含量用蛋白溶解液（20 mmol/L PBS，2%SDS，8 mol/L Urea，pH8.0）充分溶解蛋白樣品后的蛋白含量表示。

溶解度(%) =上清液蛋白質(zhì)含量/總蛋白質(zhì)含量 ×100%

1.2.9接觸角測(cè)定

接觸角是三相（液、固、氣）接觸點(diǎn)的切角，是測(cè)定粉體潤濕性的常用參數(shù)。由于潤濕行為是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，因此可以通過監(jiān)測(cè)接觸角的變化率來量化潤濕過程。用接觸角測(cè)量儀測(cè)量粉體的水接觸角變化。設(shè)置的參數(shù)為5μL水滴體積和介質(zhì)滴定速率。記錄0~60 s的接觸角。每個(gè)樣品的測(cè)量至少重復(fù)5次。

1.2.10表面張力測(cè)定

采用全自動(dòng)表面張力儀，以及最大壓力法測(cè)定不同pH下濃度為1%（w/v）的蛋清溶液表面張力。

1.2.11乳化性和乳化穩(wěn)定性測(cè)定

蛋清蛋白的乳化活性指數(shù)（emulsifying ability index，EAI）和乳化穩(wěn)定性（emulsifying stability index，ESI）測(cè)定。制備不同pH（2.0、4.0、6.0、8.0、10.0）含1%（w/v）蛋清蛋白的溶液，取15 mL溶液與5 mL玉米油混合，在10000 r/min條件下高速均質(zhì)1 min。分別在0、30 min時(shí)從離心管底部取50μL溶液，加入到4950μL 0.1%SDS溶液中，渦旋5 s混勻，立即在500 nm波長處測(cè)定吸光度。

為時(shí)間差/min；At為放置30 min后吸光度。

1.2.12起泡性和泡沫穩(wěn)定性

測(cè)定蛋清蛋白的起泡性（foaming capacity，F(xiàn)C）和泡沫穩(wěn)定性（foaming stability，F(xiàn)S），將蛋清蛋白溶液稀釋至1%（w/v），調(diào)節(jié)pH至2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，用高速分散器以10000 r/min的速度均質(zhì)1 min，記錄均質(zhì)前后體積。將樣品靜置30 min后，再次記錄樣品體積。

式中：V1為均質(zhì)前體積（mL）；V2為均質(zhì)后體積（mL）；V3為均質(zhì)30 min后體積（mL）。

1.2.13乳液的微觀結(jié)構(gòu)分析

1.2.13.1乳液的制備

蛋清蛋白乳液的制備:90 mL含1%（w/v）蛋清蛋白溶液的超純水作為乳液的水相，10 mL玉米油為油相，10000 r/min條件下高速均質(zhì)2 min，分別50 MPa高壓均質(zhì)0、1、2次（分別用EWP-P0、EWP-P1、EWP-P2和EWP-D0、EWP-D1、EWP-D2表示）。加入0.02%NaN3作為防腐劑，抑制細(xì)菌增長。

1.2.13.2熒光倒置顯微鏡

用熒光倒置顯微鏡觀察蛋清液及不同干燥方式蛋清粉均質(zhì)不同次數(shù)后乳液的微觀結(jié)構(gòu)。取20μL乳液置于載玻片上，并用蓋玻片小心的蓋住。平衡2 min后，拍攝放大率為400倍下的蛋清蛋白乳液的微觀結(jié)構(gòu)照片。

1.2.13.3激光掃描共聚焦顯微鏡

參考Xu等的方法并作適當(dāng)修改。將樣品用0.1%（w/v）的尼羅紅和FITC試劑染色，并在黑暗中孵育10 min。在室溫下避光環(huán)境中由Leica TCS SP8系統(tǒng)在激發(fā)波長為488 nm下（放大倍數(shù)為400倍）進(jìn)行分析。

1.3數(shù)據(jù)處理

所有的試驗(yàn)均至少重復(fù)三次取平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差，利用IBM SPSS Statistics 21軟件和Duncan多重檢驗(yàn)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性分析，并采用Origin 9.0軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及畫圖。

2.結(jié)果與分析

2.1不同干燥方式蛋清蛋白的SDS-PAGE分析

如圖1所示，蛋清中主要含有三種蛋白：卵清蛋白（45 kDa）、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白（76 kDa）和卵粘蛋白。卵粘蛋白主要有α-和β-兩個(gè)亞基，α-卵粘蛋白又分為兩種類型：α1-和α2-，分子量分別為150和220 kDa；β-卵粘蛋白的分子量為400~720 kDa。非還原條件下SDS-PAGE上方出現(xiàn)許多高聚物條帶，添加β-巰基乙醇后，高聚物條帶消失，表明該高聚物由蛋白通過二硫鍵聚合而成。蛋清蛋白中原有的卵類粘蛋白與溶菌酶在本實(shí)驗(yàn)室并未被檢測(cè)到，可能是由于卵類粘蛋白在蛋清前處理將稀釋、調(diào)節(jié)pH和攪拌時(shí)會(huì)發(fā)生絮凝，形成白色絮狀物，從而被離心除去。溶菌酶的不可逆變性臨界點(diǎn)是77℃，因此噴霧干燥（溫度高達(dá)180℃）過程中溶菌酶可能會(huì)變性從而造成損失。此外，冷凍干燥也會(huì)造成溶菌酶的損失，如Kudre等在比較日本鵪鶉（Coturnix japonica）和白來航雞（White Leghorn）冷凍干燥蛋清粉的SDS-PAGE時(shí)也發(fā)現(xiàn)了冷凍干燥過程中溶菌酶損失的現(xiàn)象。蛋清蛋白各組分在還原條件（圖1A）下的分子量略大于非還原條件（圖1B），這是因?yàn)镾DS與蛋白質(zhì)結(jié)合會(huì)引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，使蛋白質(zhì)形成一種長橢圓棒狀結(jié)構(gòu)，加入足夠量的SDS和β-巰基乙醇可使蛋白質(zhì)的遷移速率僅與蛋白質(zhì)分子大小有關(guān)。未加入β-巰基乙醇（非還原狀態(tài)）時(shí)蛋白質(zhì)遷移速度更快可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)中的二硫鍵未打開，蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合形成長橢圓棒狀物的長軸較短，遷移速度更快，因此蛋白質(zhì)條帶的分子量較小。EWP-C、EWP-P和EWP-D蛋白條帶幾乎沒有區(qū)別，表明本實(shí)驗(yàn)的干燥條件未對(duì)蛋清蛋白組分造成明顯影響。

圖1蛋清液和不同干燥方式蛋清粉蛋白質(zhì)模式圖

注：M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker；OVA.卵清蛋白；OVT.卵轉(zhuǎn)鐵蛋白；1.EWP-C；2.EWP-P；3.EWP-D。