摘要

膜蛋白承擔(dān)了生物膜的主要功能，是新藥研發(fā)最重要的靶點(diǎn)群，大約60%的藥物以膜蛋白為靶點(diǎn)。由于膜蛋白在水溶液中有明顯的聚集和變性傾向，在體外很難模擬維持膜蛋白正確構(gòu)象的類膜環(huán)境，導(dǎo)致膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能以及相關(guān)配體藥物的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于水溶性蛋白。膜蛋白穩(wěn)定技術(shù)對(duì)于建立高專屬性、高靈敏度和高通量的膜蛋白配體藥物篩選方法具有重要的意義。本文綜述了目前用于穩(wěn)定分離純化膜蛋白的一些技術(shù)，包括洗滌劑、人造膜、聚合物、慢病毒顆粒等，以及這些技術(shù)在藥物篩選中的具體應(yīng)用。

正文

膜蛋白(membrane proteins,MPs)是細(xì)胞膜的重要組成部分,在物質(zhì)運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞間識(shí)別等多種細(xì)胞功能中發(fā)揮著重要作用。人類基因組中編碼的MPs約占總蛋白質(zhì)組的25%。這些MPs與囊性纖維化、動(dòng)脈粥樣硬化、帕金森病和阿爾茨海默病等多種疾病相關(guān)[1]。MPs暴露在細(xì)胞外的區(qū)域是許多藥物作用的潛在靶點(diǎn),據(jù)估計(jì)MPs是60%藥物的靶點(diǎn)[2],如ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[3]、核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[4]、G蛋白偶聯(lián)受體[5]、微囊蛋白-1[6]等。一些MPs可調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)使藥物直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),或者以通道的形式幫助藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮藥效;而另一些MPs則主動(dòng)從細(xì)胞中泵出藥物,因此MPs可以極大地影響藥物的治療效果。

作為最具前景的藥物潛在靶點(diǎn)群,MPs的分離純化對(duì)于其結(jié)構(gòu)和功能研究以及新藥研發(fā)具有重大意義。研究發(fā)現(xiàn)MPs需要維持脂質(zhì)雙分子層或類脂環(huán)境才可以保持其天然構(gòu)象,但是這種環(huán)境在體外很難模擬;并且MPs在水溶液中還有明顯的聚集和變性傾向,因此MPs的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究十分滯后。目前已知結(jié)構(gòu)的蛋白中只有2%~3%是MPs[7]。此外,MPs的表達(dá)量一般都較低,難以被分離純化得到足夠量的目標(biāo)MPs。如何將MPs分離純化并獲得穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)是MPs研究的難點(diǎn)問(wèn)題。針對(duì)MPs脫離天然膜環(huán)境后易聚集和變性的現(xiàn)象,早期研究者提出了以表面活性劑為主的洗滌劑策略,利用其形成的膠束來(lái)分離MPs,但在應(yīng)用過(guò)程中存在一些問(wèn)題[8];進(jìn)而提出了以脂質(zhì)體、納米盤等兩親體系來(lái)模擬天然膜環(huán)境,一定程度上保證了MPs在分離純化過(guò)程中構(gòu)象和功能的完整性[9];近年來(lái)還出現(xiàn)了保護(hù)MPs周圍局部脂質(zhì)環(huán)境的聚合物穩(wěn)定技術(shù)[10]、慢病毒顆粒穩(wěn)定技術(shù)[11]等。

本文針對(duì)MPs穩(wěn)定技術(shù)進(jìn)行綜述,包括傳統(tǒng)和新型的洗滌劑、人造膜、聚合物、慢病毒顆粒等穩(wěn)定技術(shù)以及其在藥物篩選中的具體應(yīng)用,為下游MPs結(jié)構(gòu)和功能研究提供可靠的技術(shù)支持,促進(jìn)以MPs為靶點(diǎn)的新藥研發(fā)和中藥活性成分的高通量篩選。

01、洗滌劑穩(wěn)定技術(shù)(detergent)

早期的MPs穩(wěn)定主要采用洗滌劑策略實(shí)現(xiàn)。洗滌劑是以表面活性劑為主的一類混合物的統(tǒng)稱,它能降低兩種不混溶液體之間的界面張力[12]。洗滌劑的整體分子結(jié)構(gòu)由親水的極性頭基團(tuán)和疏水的非極性尾基團(tuán)組成。水溶液中,細(xì)胞膜以脂質(zhì)雙分子層的形式存在,洗滌劑分子在高于臨界膠束濃度(critical micelle concentration,CMC)時(shí)以膠束形式存在。當(dāng)細(xì)胞膜和洗滌劑膠束混合時(shí),洗滌劑分子首先以非協(xié)同的方式結(jié)合在細(xì)胞膜表面,隨著洗滌劑數(shù)量的增加,洗滌劑分子從細(xì)胞膜表面摻入進(jìn)脂質(zhì)雙分子層內(nèi)部,此時(shí)的非協(xié)同結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)閰f(xié)同結(jié)合,洗滌劑與細(xì)胞膜的協(xié)同和非協(xié)同結(jié)合稱為跨雙分子層機(jī)制[13]。隨著越來(lái)越多的洗滌劑被合并到膜中,脂-洗滌劑混合膠束形成,細(xì)胞膜被裂解,洗滌劑成功地提取MPs形成膠束,過(guò)程如圖1所示。

1.1傳統(tǒng)洗滌劑

傳統(tǒng)洗滌劑包括N-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(N-octyl-β-D-glucopyranoside,OG)、N-癸基-β-D-麥芽糖苷(N-decyl-β-D-maltoside,DM)、N-十二烷基-β-D-麥芽糖苷(N-dodecyl-β-D-maltoside,DDM)、N-壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷(N-nonyl-β-D-pyranoglucoside,NG)和月桂基二甲基氧化胺(lauryl dimethylamine oxide,LDAO)。其中DDM作為最經(jīng)典的洗滌劑,通常是MPs提取的首選洗滌劑[14]。不同洗滌劑對(duì)于MPs的分離純化有各自不同的傾向性。Iwata等[15]發(fā)現(xiàn)DDM對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和呼吸復(fù)合物的分離作用較好,而OG對(duì)通道蛋白的分離作用較好。Newstead等[16]發(fā)現(xiàn)LDAO會(huì)導(dǎo)致大多數(shù)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白聚集。Simon等[17]的研究表明DDM、DM、OG、NG對(duì)于α螺旋蛋白提取效率相近。有報(bào)道[18]稱在LDAO中,電壓依賴性陰離子通道蛋白可保持穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。此外,不同類型的洗滌劑提取MPs時(shí)所需的磷酸鹽濃度也不同。Metola等[19]研究發(fā)現(xiàn)在較高的磷酸鹽濃度時(shí),兩性離子型洗滌劑LDAO比非離子型洗滌劑DDM有更高的提取效率。不同類型洗滌劑對(duì)蛋白的穩(wěn)定性也不同,據(jù)估計(jì)只有20%的MPs能在LDAO中維持穩(wěn)定[20];相比之下,非離子型洗滌劑DDM中大部分蛋白質(zhì)穩(wěn)定性明顯優(yōu)于LDAO,但非離子型洗滌劑的提取效率往往低于兩性離子型洗滌劑。在傳統(tǒng)洗滌劑的應(yīng)用過(guò)程中,研究者們描述的共性問(wèn)題在于膠束中的MPs穩(wěn)定性不高,很難保持MPs的天然構(gòu)象,限制了MPs結(jié)構(gòu)和功能研究及其下游應(yīng)用。

1.2新型洗滌劑

針對(duì)傳統(tǒng)洗滌劑中MPs穩(wěn)定性不高的問(wèn)題,研究者開發(fā)出一系列新型洗滌劑,主要有:環(huán)戊烷基麥芽糖苷、杯芳烴基洗滌劑、不對(duì)稱麥芽糖新戊二醇、線性和支化甘露醇基兩親體、三苯基核麥芽糖苷等。它們與傳統(tǒng)洗滌劑相比,能更好地穩(wěn)定MPs。

Das等[21]制備了一類以環(huán)戊烷為核心單元的新型非對(duì)映體洗滌劑,即環(huán)戊烷基麥芽糖苷(cyclopentyl maltosides,CPMs),并對(duì)其穩(wěn)定幾種模型MPs的能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)。與常規(guī)洗滌劑DDM相比,CPMs對(duì)包括兩個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)在內(nèi)的所有被測(cè)MPs表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性和提取效率。而Hardy等[22]開發(fā)的杯芳烴基洗滌劑具有更高的熱穩(wěn)定性。在杯芳烴基洗滌劑中,MPs能保持穩(wěn)定的溫度與經(jīng)典洗滌劑DDM相比至少提高了30℃。Hyoung等[23]制備了一系列的不對(duì)稱麥芽糖新戊二醇(neopentyl maltose glycols,NMGs),并對(duì)它們的MPs溶解和穩(wěn)定性能進(jìn)行評(píng)估,包括兩種G蛋白偶聯(lián)受體,結(jié)果顯示與DDM相比,MNGs對(duì)所測(cè)的MPs有更高的穩(wěn)定性。此外還有很多比經(jīng)典洗滌劑DDM性能更好的洗滌劑,如基于間苯二酚的葡萄糖苷和麥芽糖苷的兩親性洗滌劑[24](分別稱為RGAs和RMAs)、三苯基核麥芽糖苷洗滌劑[25](triphenyl maltosides,TPMs)、錫基肌醇苷洗滌劑[26](tin inositol glycoside,SIGs)等都在一定程度上具有更高的MPs穩(wěn)定性和提取效率。Hussain等[27]設(shè)計(jì)合成了線性和支化甘露醇基兩親體(mannitol amphiphilics,MNAs),通過(guò)比較研究表明,大多數(shù)支化MNAs在MPs穩(wěn)定性方面都優(yōu)于線性MNAs。內(nèi)容由藥時(shí)通小編查閱文獻(xiàn)選取，排版與編輯為原創(chuàng)。如轉(zhuǎn)載，請(qǐng)尊重勞動(dòng)成果，注明來(lái)源于藥時(shí)通公眾號(hào)。

盡管新型洗滌劑在一定程度上提高了分離純化過(guò)程中MPs的穩(wěn)定性,但新舊洗滌劑都有一些共性的缺陷[28]:①對(duì)于未知性質(zhì)MPs的分離、純化和穩(wěn)定的洗滌劑選擇,需要進(jìn)行廣泛篩選;②洗滌劑以形成膠束的形式分離純化MPs,常常會(huì)導(dǎo)致MPs失去與脂質(zhì)和其他蛋白質(zhì)的天然相互作用;③穩(wěn)定分離MPs效果好的洗滌劑有時(shí)會(huì)干擾下游應(yīng)用。因此,無(wú)法預(yù)測(cè)哪種洗滌劑對(duì)給定的蛋白質(zhì)最有效,需要通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。

02、人造膜穩(wěn)定技術(shù)

針對(duì)洗滌劑策略的不足,研究者們提出了新的模擬天然膜環(huán)境的兩親體系的人造膜策略。該策略的靈感來(lái)自新興的納米科學(xué),充分考慮了磷脂雙分子層的復(fù)雜性和維持MPs活性的重要性,確保在局部膜環(huán)境中穩(wěn)定地分離純化MPs。人造膜穩(wěn)定MPs的基本原理是將二油酰基磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰甘油、棕櫚油酰磷脂酰膽堿、膽固醇等細(xì)胞膜含有的磷脂類成分,采用不同的反應(yīng)條件,制備成脂質(zhì)體、雙胞體和納米圓盤等多種形式,并與純化或重組的MPs按一定比例混合,即可實(shí)現(xiàn)MPs-人造膜鑲嵌模型重構(gòu)。

2.1脂質(zhì)體(liposome)

脂質(zhì)體是將兩性分子如磷脂和鞘脂分散于水相,分子的疏水尾部?jī)A向于聚集在一起,避開水相,而親水頭部暴露在水相,形成具有雙分子層結(jié)構(gòu)的封閉囊泡。脂質(zhì)體可由純脂質(zhì)或混合脂質(zhì)制備,其比例可根據(jù)目的蛋白進(jìn)行調(diào)整。脂質(zhì)體的大小可通過(guò)分散制備步驟進(jìn)行調(diào)整,如膨脹[29]、擠壓[30]、乳化、超聲波、電形成[31]、噴墨形成和凍融循環(huán)等。對(duì)于MPs中的轉(zhuǎn)運(yùn)體如核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,脂質(zhì)體有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。重組脂質(zhì)體可以通過(guò)選擇性濃縮脂質(zhì)體內(nèi)底物對(duì)MPs進(jìn)行功能完整性測(cè)試。同樣,如果蛋白脂質(zhì)體是在底物存在下形成,也可以進(jìn)行反向評(píng)估[32]。此外,脂質(zhì)體中脂質(zhì)的比例和種類會(huì)極大的影響MPs的活性、穩(wěn)定性和結(jié)晶性能[33]。脂質(zhì)體可以通過(guò)穩(wěn)定蛋白質(zhì)折疊、單體和亞單位之間的聯(lián)系來(lái)促進(jìn)結(jié)晶,也可以通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的晶格接觸來(lái)促進(jìn)結(jié)晶,從而測(cè)定MPs的結(jié)構(gòu)和功能以及相應(yīng)的藥物靶點(diǎn)研究。Kurisu等[34]發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)磷脂相比,加入非天然脂質(zhì)二油酰基卵磷脂(DOPC)可以促進(jìn)了藍(lán)藻細(xì)胞色素b6f復(fù)合體的結(jié)晶。Jidenko等[35]用洗滌劑/DOPC混合物溶解并結(jié)晶得到在酵母中過(guò)表達(dá)的哺乳動(dòng)物Ca2+-ATP酶。

2.2雙胞體(bicelles)

雙胞體是由長(zhǎng)鏈磷脂和短鏈脂質(zhì)(或洗滌劑)混合形成的自組裝圓盤結(jié)構(gòu)[36],長(zhǎng)鏈磷脂形成含MPs的雙分子層,然后由位于雙分子層邊緣的短鏈脂質(zhì)穩(wěn)定。目前最常用的組合是二己酰磷脂酰膽堿(DHPC,短脂)和二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC,長(zhǎng)脂)的組合。根據(jù)長(zhǎng)脂與短脂的比例、溫度、pH值和鹽濃度的不同,雙胞體具有不同的構(gòu)象。雙胞體是介于脂質(zhì)體囊泡和經(jīng)典洗滌劑膠束之間的一種中間形態(tài),結(jié)合了這兩種系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)。與脂質(zhì)體相比,雙胞體更容易實(shí)現(xiàn)均勻混合;與經(jīng)典洗滌劑膠束相比,雙胞體中洗滌劑用量更低,并且更加接近天然的膜環(huán)境[37]。但雙胞體也有其局限性,如[DMPC]:[DHPC]的合適比例往往難以控制。在雙胞體中洗滌劑交換步驟有時(shí)會(huì)導(dǎo)致MPs的聚集,存在洗滌劑使用相關(guān)問(wèn)題的限制。

2.3納米盤(nanodisc)

納米盤由磷脂和兩親性螺旋蛋白,也稱膜支架蛋白(membrane scaffold protein,MSP)組成。一般由130~160個(gè)磷脂形成含MPs的雙分子層,然后由MSP作為與MPs結(jié)合的疏水基團(tuán)保持其天然構(gòu)象[38]。單個(gè)MPs可形成150 kDa大小的納米盤。組裝納米盤時(shí),首先將MSP按照一定比例與預(yù)先溶解在洗滌劑(通常是膽酸鈉)中的磷脂混合,孵育一段時(shí)間后利用透析或疏水吸附劑去除洗滌劑,隨后納米盤自行組裝形成納米級(jí)別類膜結(jié)構(gòu)圓盤[39]。組裝包含MPs的納米盤只需在體系中再加入適量MPs,其自組裝過(guò)程與空納米盤相似。包含MPs的納米盤與空納米盤通過(guò)生化手段進(jìn)行分離,隨后用分子排阻色譜進(jìn)一步純化,過(guò)程如圖2所示[40]。

對(duì)于MPs的穩(wěn)定分離純化而言,納米盤體系可以在溶液中提供類膜環(huán)境,它具有和細(xì)胞膜一樣的脂質(zhì)組成。與其他人造膜相比,MSP的添加可以更好地穩(wěn)定MPs的天然構(gòu)象。應(yīng)用納米盤開展的MPs研究較廣泛,GPCR家族蛋白β2AR被證明在納米盤體系中可以保持蛋白的結(jié)構(gòu)完整和功能活性[38]。此外Yao等[41]使用納米盤研究B細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因表達(dá)的抗凋亡蛋白(BCL-XL)在其膜環(huán)境下的構(gòu)象和功能,結(jié)果顯示納米盤并未改變BCL-XL的N端的球狀結(jié)構(gòu),并且增強(qiáng)了其BH3配體的結(jié)合活性。針對(duì)傳統(tǒng)的納米盤的構(gòu)型,Nasr等[42]設(shè)計(jì)了共價(jià)環(huán)化納米盤(covalently circularized nanodiscs,CNDs),其較傳統(tǒng)納米盤具有更高的穩(wěn)定性、可控的直徑和形狀可調(diào)等優(yōu)點(diǎn),被應(yīng)用到電壓依賴性陰離子通道蛋白-1(VDAC-1)和G蛋白偶聯(lián)受體-NRT1上。

與雙胞體一樣,納米盤的第一步是基于洗滌劑的增溶,需要優(yōu)化所使用的洗滌劑的性質(zhì)和濃度,這在納米盤重組中可能造成蛋白質(zhì)活性損失,因此同樣存在洗滌劑使用相關(guān)問(wèn)題的限制。表1[34,35,41-45]比較了脂質(zhì)體、雙胞體、納米盤的組成及其優(yōu)缺點(diǎn)。

03、聚合物穩(wěn)定技術(shù)

針對(duì)洗滌劑和人造膜分離純化和穩(wěn)定MPs的不足,研究人員從保護(hù)MPs周圍局部脂質(zhì)環(huán)境的思路出發(fā),開發(fā)出了完全不添加洗滌劑的新方法,采用包括苯乙烯馬來(lái)酸、二異丁烯馬來(lái)酸、聚甲基丙烯酸酯等聚合物來(lái)穩(wěn)定含有MPs的納米級(jí)脂質(zhì)圓盤。

3.1苯乙烯-馬來(lái)酸酐(styrene maleic anhydride,SMA)聚合物

SMA是苯乙烯和馬來(lái)酸酐通過(guò)自由基聚合得到一種性能優(yōu)良的共聚物,該聚合物由親水性的馬來(lái)酸和疏水性的苯乙烯交替組成[46]。SMA和大約140個(gè)脂質(zhì)組成苯乙烯-馬來(lái)酸酐脂質(zhì)顆粒(SMA lipid particles,SMALPs)[47]。組裝SMALPs時(shí),首先將細(xì)胞懸液破碎處理,然后將一定量SMA添加到pH值≥6.5的細(xì)胞破碎懸液中,孵育一段時(shí)間后可發(fā)現(xiàn)該混合體系變澄清,表明SMALPs自組裝完成[48],接下去采用光散射技術(shù)來(lái)檢測(cè)SMALPs組裝完成后的物理參數(shù)。Xue等[49]通過(guò)研究SMALPs自組裝過(guò)程發(fā)現(xiàn),SMA共聚物首先將末端的苯乙烯基團(tuán)結(jié)合到膜表面,隨后疏水相互作用驅(qū)動(dòng)苯乙烯基團(tuán)插入脂質(zhì)雙分子層的中心。當(dāng)SMA共聚物的疏水側(cè)鏈完全插入時(shí),局部脂質(zhì)雙分子層產(chǎn)生波動(dòng),形成小的跨膜孔。隨著跨膜孔生長(zhǎng),SMA將羧基定向到跨膜孔上,并且在脂質(zhì)尾部之間插入苯基來(lái)穩(wěn)定邊緣,從而完成SMALPs自組裝,SMA提取純化膜蛋白過(guò)程如圖3所示[50]。

目前SMA方法已經(jīng)成功地應(yīng)用于穩(wěn)定和分離純化離子通道蛋白[51]、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[51]、酶[52]、呼吸鏈復(fù)合物[53]以及受體[54]等。當(dāng)苯乙烯與馬來(lái)酸的比例為2∶1或3∶1時(shí),SMA對(duì)MPs的分離純化效果最好。另外SMA的提取效率還受到目標(biāo)蛋白的大小和蛋白在膜中的包裹密度的影響[46]。與洗滌劑和人造膜相比,SMA的優(yōu)勢(shì)在于其通過(guò)SMALPs的自發(fā)組裝將目標(biāo)蛋白與天然脂質(zhì)雙分子層以及相關(guān)蛋白一起提取。這不僅提供了相關(guān)蛋白與目標(biāo)蛋白相互作用的信息,而且還提供了一種識(shí)別目標(biāo)蛋白周圍內(nèi)源性脂質(zhì)組成的方法。此外,純化成SMALPs的MPs具有顯著的穩(wěn)定性,在4℃時(shí)SMALPs至少能保持一周穩(wěn)定,在經(jīng)過(guò)幾輪凍融循環(huán)后,SMALPs顆粒完整性和蛋白功能損失最小[55]。

但SMA對(duì)低pH和二價(jià)陽(yáng)離子不耐受的特點(diǎn)限制了該策略在MPs下游研究中的應(yīng)用[56,57],因此人們對(duì)SMA進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,合成SMA-ED、SMAd-A[58]和SMI[59]等pH值可調(diào)和耐受二價(jià)陽(yáng)離子的聚合物脂質(zhì)納米盤,有望成功應(yīng)用于MPs的穩(wěn)定提取上。

3.2二異丁烯-馬來(lái)酸(diisobutylene maleic acid,DIBMA)聚合物

SMA對(duì)二價(jià)陽(yáng)離子耐受性低,限制了Mg2+和Ca2+等陽(yáng)離子的使用,而這些陽(yáng)離子通常用于蛋白質(zhì)純化和活性測(cè)定的緩沖液中。最近有研究表明,二異丁烯-馬來(lái)酸(DIBMA)共聚物也能夠直接溶解膜,形成DIBMA脂質(zhì)顆粒(DIBMALPs),可以克服上述SMA局限性。Oluwole等[60]發(fā)現(xiàn)DIBMALPs比SMALPs對(duì)二價(jià)陽(yáng)離子如Mg2+耐受性更高。當(dāng)Mg2+濃度超過(guò)4 mmol·L-1時(shí),SMALPs內(nèi)的蛋白質(zhì)開始聚集變性,在Mg2+濃度為8~10 mmol·L-1時(shí)蛋白質(zhì)全部失活。但在DIBMALPs中,當(dāng)Mg2+濃度為10 mmol·L-1時(shí),只有20%的蛋白質(zhì)變性失活。Danielczak等[61]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用DIBMA時(shí),添加Mg2+或Ca2+可以提高提取效率。盡管DIBMA對(duì)于某些MPs的提取純度和穩(wěn)定性要比SMA低,但DIBMA對(duì)二價(jià)陽(yáng)離子有更高的耐受性,可以為蛋白質(zhì)構(gòu)象和動(dòng)力學(xué)的研究提供了更好的環(huán)境[62]。因此,選擇哪種聚合物取決于所研究的目標(biāo)蛋白的特征。

3.3聚甲基丙烯酸酯(polymethacrylate,PMA)聚合物

盡管SMA和DIBMA在一些MPs的分離純化中取得了成功[63],但存在SMA對(duì)二價(jià)陽(yáng)離子耐受性低、DIBMA提取純度和穩(wěn)定性低的缺陷并且這兩種聚合物都有強(qiáng)烈的紫外吸收,可能干擾紫外檢測(cè)[57]。因此人們開始尋找非“烯烴-馬來(lái)酸支架”替代聚合物。最近,兩親性聚甲基丙烯酸酯聚合物(polymethacrylate,PMA)被證明可將脂質(zhì)雙分子層溶解成納米圓盤。PMA比常見的苯乙烯-馬來(lái)酸聚合物具有潛在的優(yōu)勢(shì),但目前PMA對(duì)于MPs的純化應(yīng)用較少[64]。Lavington等[63]以神經(jīng)緊張素受體1(NTSR1)為對(duì)象,探索使用PMA的無(wú)洗滌劑純化。通過(guò)使用Sf9細(xì)胞中表達(dá)的NTSR1-eGFP融合蛋白,篩選了一系列的增溶條件,證明了溫度、pH、NaCl濃度以及聚合物和膜樣品的相對(duì)數(shù)量的重要性。此外還發(fā)現(xiàn)PMA對(duì)二價(jià)陽(yáng)離子有一定耐受性。PMA溶解的NTSR1比洗滌劑溶解的NTSR1表現(xiàn)出更大活性,這表明PMALPs為NTSR1提供了更天然的膜環(huán)境[63]。因此,PMA是一種可替代SMA的MPs純化方法,在研究NTSR1和其他MPs方面具有良好的前景。表2比較了SMA、DIBMA、PMA的組成、優(yōu)缺點(diǎn)及其應(yīng)用。

04、慢病毒載體穩(wěn)定技術(shù)

慢病毒(lentivirus)載體是以人類免疫缺陷I型病毒(HIV-1)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因載體。慢病毒載體可以將外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色體上,從而達(dá)到持久性表達(dá)目的基因的效果。基于慢病毒顆粒(lentivirus particles,LVPs)作為MPs載體的策略是將目的基因插入慢病毒轉(zhuǎn)染所需的質(zhì)粒當(dāng)中,慢病毒從包裝細(xì)胞出芽的過(guò)程中會(huì)攜帶包裝細(xì)胞的細(xì)胞膜片段,從而獲得細(xì)胞膜上的MPs[65]。這種慢病毒穩(wěn)定策略具有以下優(yōu)點(diǎn):①慢病毒顆粒表面的MPs受體表達(dá)水平高,活性高;②慢病毒顆粒可以直接固定在芯片上,無(wú)需標(biāo)記;③慢病毒顆粒易于表達(dá)和純化。因此,基于慢病毒顆粒的穩(wěn)定策略在研究MPs與配體之間的相互作用方面有巨大潛力,Heym等[11]將慢病毒顆粒結(jié)合表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR)和表面聲波技術(shù)應(yīng)用于GPCR與其配體(CXCR4抗體-12G5、AMD3100)的結(jié)合動(dòng)力學(xué)研究。結(jié)果顯示,該方法得到的動(dòng)力學(xué)參數(shù)和親和參數(shù),與經(jīng)典的細(xì)胞親和實(shí)驗(yàn)測(cè)量值一致,為靶向GPCRs的小分子動(dòng)力學(xué)分析提供基礎(chǔ)。此外,Hoffman等[66]構(gòu)建LVPs-SPR體系來(lái)研究趨化因子受體4(cx-chemokine receptor 4,CXCR4)與其配體的相互作用。以293T細(xì)胞為宿主,構(gòu)建了高/低表達(dá)CXCR4的慢病毒顆粒,并將其偶聯(lián)在Biacore F1芯片上進(jìn)行CXCR4的抗體親和力評(píng)估。表3總結(jié)比較了上述MPs穩(wěn)定技術(shù)的原理、分類以及優(yōu)缺點(diǎn)。

05、MPs穩(wěn)定技術(shù)結(jié)合表面等離子共振技術(shù)在藥物篩選中的應(yīng)用

MPs配體藥物篩選和MPs的生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)是目前新藥研發(fā)的重要方向。據(jù)統(tǒng)計(jì)在DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)中,已批準(zhǔn)的藥物靶點(diǎn)中有54%是MPs。截至2017年,FDA批準(zhǔn)的分子靶標(biāo)中只有667個(gè)是蛋白質(zhì),而在DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的MPs靶標(biāo)總數(shù)為3 041個(gè)[2,67]。可見,批準(zhǔn)的MPs靶標(biāo)數(shù)遠(yuǎn)少于MPs靶標(biāo)總數(shù)。MPs的低表達(dá)量以及強(qiáng)疏水性等特點(diǎn)限制了MPs靶標(biāo)的體外研究以及配體藥物篩選。因此,MPs穩(wěn)定技術(shù)結(jié)合表面等離子共振技術(shù)的發(fā)展給眾多待開發(fā)的潛在MPs靶標(biāo)和相關(guān)配體藥物篩選帶來(lái)了曙光。

目前針對(duì)MPs的配體高通量篩選技術(shù)中最具代表性的是SPR。它是一種敏感的表面分析技術(shù),它是通過(guò)分子吸附在重金屬膜上引起介電常數(shù)的變化來(lái)進(jìn)行檢測(cè),自20世紀(jì)90年代以來(lái),這種方法被廣泛用于簡(jiǎn)單的蛋白配體以及小分子藥物的高通量篩選[68]。Johzuka等[69]建立了高精度表面等離振子共振(HP-SPR)-3D系統(tǒng),它能在加藥1 h內(nèi)對(duì)抗癌藥物進(jìn)行模擬體內(nèi)表型篩選。Wang等[70]模擬了PD-1/PD-L1在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)界面上的潛在結(jié)合區(qū)域,在內(nèi)部肽庫(kù)中結(jié)合虛擬篩選和SPR親和力評(píng)估,得到三種PD-1靶向肽抑制劑。此外,SPR也成功應(yīng)用于表皮生長(zhǎng)因子受體的配體[71]、泛素化抑制劑[72]、IL-6家族細(xì)胞因子受體GP130 PPI抑制劑[73]的篩選。

然而,對(duì)于GPCR、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等表達(dá)量低且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多次跨MPs,當(dāng)它們直接與固體底物特別是Biacore系統(tǒng)中的金底物接觸時(shí),MPs通常會(huì)失去功能或變性。所以,研究者們引入MPs穩(wěn)定技術(shù)獲得活性良好的MPs,再與SPR結(jié)合用于其相應(yīng)的配體藥物的篩選。Komolov等[74]將洗滌劑穩(wěn)定化的視紫紅質(zhì)蛋白偶聯(lián)于SPR芯片表面,成功用于分析視紫紅質(zhì)蛋白與其配體間的相互作用。與經(jīng)典的洗滌劑策略相比,人造膜穩(wěn)定策略結(jié)合SPR技術(shù)在MPs配體篩選以及新藥研發(fā)中應(yīng)用更為廣泛。Oshima等[75]將包裹有hERG通道蛋白的人工雙層脂質(zhì)膜重建在硅芯片的微孔中,評(píng)價(jià)了這個(gè)體系的耐用性,隨后Tadaki等[76]優(yōu)化了該組裝過(guò)程,Komiya等[36]根據(jù)優(yōu)化后條件,將該系統(tǒng)定量評(píng)價(jià)西沙必利對(duì)細(xì)胞合成hERG鉀通道的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用該體系測(cè)得的IC50與膜片鉗法測(cè)量值一致,最終建立了作用于hERG鉀離子通道的藥物快速篩選平臺(tái)。Das等[45]將納米盤穩(wěn)定技術(shù)和局域表面等離子體共振技術(shù)(LSPR)結(jié)合,用于分析12種小分子藥物與細(xì)胞色素P450 3A4酶的結(jié)合類型。結(jié)果顯示,溴隱亭、睪酮、洛伐他汀、阿德司瓊、α-萘酚酮、紅霉素和硝苯地平為I型藥物,通過(guò)取代配位水分子來(lái)調(diào)節(jié)酶活性;酮康唑、伊曲康唑、曲酰環(huán)丙胺、雙氯芬酸和特非那定為II型藥物,通過(guò)直接與鐵結(jié)合來(lái)抑制酶。Maynard等[77]為解決GPCR配體篩選方法的局限性,首先用脂質(zhì)雙分子層將GPCR分離純化,隨后通過(guò)納米孔將其固定在芯片上,用SPR技術(shù)采集GPCR配體結(jié)合的劑量-反應(yīng)曲線,建立了GPCR配體的高通量篩選平臺(tái)。Rich等[78]以SPR技術(shù)建立了CCR5蛋白最佳的增溶條件篩選體系,以抗體Fab(2D7)為陽(yáng)性藥,在96種不同的洗滌劑中找出既能有效溶解受體又能保持其活性的洗滌劑,結(jié)果顯示大多數(shù)保持CCR5活性的去污劑是帶有C9到C13烷基尾的麥芽糖,而短(≤C8)或長(zhǎng)(≥C14)烷基鏈的麥芽糖是無(wú)效的增溶劑。Xu等[79]采用納米圓盤穩(wěn)定的離子通道蛋白KcsA-Kv1偶聯(lián)于SPR芯片上,用于分析KcsA-Kv1蛋白及其抑制劑間的相互作用。

針對(duì)慢病毒載體穩(wěn)定技術(shù)結(jié)合SPR在中藥活性成分篩選中的應(yīng)用,本課題組已展開一些探索性研究。P-糖蛋白(P-gp)是體內(nèi)最重要的外排型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,具有12次跨膜的復(fù)雜結(jié)構(gòu),且尚未商品化。Cao等[80]采用LVPs穩(wěn)定策略,獲得活性良好的P-糖蛋白,構(gòu)建了一種基于SPR的P-糖蛋白配體篩選系統(tǒng)。首先,獲得P-gp高表達(dá)和低表達(dá)的LVPs,然后將P-gp高/低表達(dá)的LVPs分別固定在CM5芯片上作為活性通道和參比通道。以P-gp抑制劑伐司樸達(dá)(valspodar,Val)和環(huán)孢素(cyclosporin,CsA)為陽(yáng)性對(duì)照,從天然產(chǎn)物庫(kù)中快速篩選出厚樸酚、和厚樸酚和白藜蘆醇作為潛在的P-gp配體(圖4)[80]。Chen等[81]構(gòu)建了CXCR4的配體篩選體系,將高/低表達(dá)的CXCR4的慢病毒顆粒固定在CM5芯片上,以趨化因子受體拮抗劑AMD3100為陽(yáng)性化合物,從川芎提取物中篩選出洋川芎內(nèi)酯Ⅰ為CXCR4的潛在配體。

MPs穩(wěn)定技術(shù)在面向結(jié)構(gòu)復(fù)雜的MPs的藥物篩選中是不可缺少的關(guān)鍵技術(shù),它能夠模擬MPs所需的天然脂質(zhì)環(huán)境,保證MPs結(jié)構(gòu)和功能的完整性,為建立高專屬性、高靈敏度和高通量的藥物篩選方法提供技術(shù)支撐。

06、小結(jié)與展望

MPs功能的完整性對(duì)于藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和新藥研發(fā)至關(guān)重要,而MPs的穩(wěn)定技術(shù)是保障其基本功能完整性的關(guān)鍵。本文總結(jié)了近年來(lái)MPs穩(wěn)定技術(shù)的發(fā)展。最初研究人員利用洗滌劑膠束來(lái)分離MPs,但此方法忽略了天然脂質(zhì)環(huán)境對(duì)MPs結(jié)構(gòu)和功能的獨(dú)特作用;人造膜穩(wěn)定技術(shù)有助于模擬MPs天然的功能和結(jié)構(gòu),但在人造膜組裝過(guò)程中仍然需要應(yīng)用洗滌劑增溶,未能避免洗滌劑應(yīng)用中產(chǎn)生的問(wèn)題;目前最新的聚合物穩(wěn)定技術(shù)在完全無(wú)洗滌劑的環(huán)境下可以將目的蛋白與天然脂質(zhì)雙分子層一起分離,使其保持天然的膜環(huán)境,能在最大程度上減少M(fèi)Ps結(jié)構(gòu)和功能的缺失;而慢病毒顆粒穩(wěn)定策略無(wú)需處理就能直接與SPR芯片結(jié)合,使得其在下游應(yīng)用特別是與SPR聯(lián)用上有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。然而上述這些策略仍然存在一些技術(shù)難點(diǎn),包括如何增加MPs提取的特異性,如何減少M(fèi)Ps提取過(guò)程中帶來(lái)的結(jié)構(gòu)和功能的缺失,需要更全面的MPs功能驗(yàn)證來(lái)確保所建立的方法的準(zhǔn)確性。因此,研究人員一直致力于開發(fā)新型MPs穩(wěn)定技術(shù),以期在維持MPs正確結(jié)構(gòu)的前提下獲得純度較高的目標(biāo)MPs。盡管MPs穩(wěn)定技術(shù)在藥物篩選中已聯(lián)合SPR技術(shù)有了一些應(yīng)用,但今后仍需拓寬其應(yīng)用范圍,以更好地服務(wù)于藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)與配體篩選。MPs的穩(wěn)定是藥物研究中亟待解決的科學(xué)問(wèn)題,開發(fā)特異性強(qiáng)、效率更高的新型MPs穩(wěn)定技術(shù)任重而道遠(yuǎn)。

作者貢獻(xiàn):方家豪負(fù)責(zé)文獻(xiàn)檢索及論文撰寫;曹雨虹負(fù)責(zé)修改文章;何宇臻負(fù)責(zé)修改文章;洪戰(zhàn)英負(fù)責(zé)文章選題、指導(dǎo)寫作、修改及校對(duì)文章。柴逸峰負(fù)責(zé)審閱文章。

利益沖突:本文無(wú)利益沖突。

作者：方家豪,曹雨虹,何宇臻,洪戰(zhàn)英柴逸峰

機(jī)構(gòu)：海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院,上海200433

來(lái)源：藥學(xué)學(xué)報(bào),2021,56(9):2325-2334.